We engineered a system in which ful

We engineered a system in which full-length Mre11 cDNA is stably
expressed from an integrated plasmid vector in cells that were Mre11cond/−. Endogenous Mre11 was subsequently removed through Cre-mediated conversion of Mre11cond/− to Mre11−/−, and independent
clones with Mre11 levels similar to endogenous were pursued for further study (Supplementary Fig. 3). Mre11 expressed from cDNA successfully reconstituted levels of Rad50 and NBS1 (Fig. 1c) and supported the ability of MRN to activate the ATM kinase, as determined by relative levels of ATM autophosphorylation (Fig. 1d)15,35. Unexpectedly, despite the apparent restoration of MRN, CtIP protein levels were not restored (Fig. 1c). This suggests that the mechanisms by which Mre11 influences CtIP levels as compared to RAD50 or NBS1 levels are distinct.
The expression system fused 54 amino acids to the Mre11
C terminus (hereafter termed Mre11C54), originating from three tags (His-V5-His). To test the possibility that this large addition prevents CtIP restoration, we reconstructed the plasmid to express Mre11 fused only to a short histidine tag composed of five amino acids (Mre11C5). Indeed, Mre11C5 expression restored CtIP (Fig. 1c). Thus, we hypothesized that the C terminus of Mre11 possesses an unknown function that controls CtIP levels. We therefore examined the impact of Mre11ATLD1 C-terminal deletion. Existing ATLD1 cell lines cannot be used to study specific roles of the Mre11 C terminus, as they also harbor low levels of the entire MRN complex30,31. To circumvent this limitation, we stably expressed Mre11ATLD1 from cDNA in Mre11−/− cells (Fig. 1c). When expressed to approximately endogenous levels, Mre11ATLD1 showed a pattern identical to the impact of Mre11C54 and restored NBS1 and Rad50
levels and ATM activation without restoration of CtIP (Fig. 1c,d). Thus, the C terminus of Mre11 possesses a distinct function required to maintain normal CtIP levels.

結果 (繁體中文) 1:

我們設計的全長 Mre11 cDNA 在穩定系統表示從綜合質粒載體中的儲存格被 Mre11cond / −。 內源性 Mre11 隨後被刪除通過介導 Cre 轉為 −，Mre11−/Mre11cond/− 和獨立與類似的內源性 Mre11 水準克隆被追求為進一步研究 (補充圖 3)。Mre11 表示從 cDNA 成功重組水準的 Rad50 和 NBS1 (圖 1 c) 並支援 MRN 能夠啟動 ATM 激酶，由 ATM 自動 (圖 1 d) 磷酸化的相對水準 15 歲，35 歲。出乎意料的是，儘管 MRN 明顯恢復，CtIP 蛋白水準未恢復 (圖 1 c)。這表明，其中 Mre11 影響 CtIP 水準與 RAD50 或 NBS1 級別的機制不同。表達系統融合到 Mre11 54 氨基酸C 總站 (以下簡稱稱為 Mre11C54)，起源于三個標籤 (他-V5-他)。若要測試此大加防止 CtIP 恢復的可能性，我們根據重組質粒表達 Mre11 融合只到五個氨基酸 (Mre11C5) 組成的一個短的組氨酸標籤。事實上，Mre11C5 表達恢復 CtIP (圖 1 c)。因此，我們假設 Mre11 C 總站擁有控制 CtIP 級別未知的函數。我們因此審查了 Mre11ATLD1 C-末端缺失的影響。現有 ATLD1 細胞系不能用於研究特定角色的 Mre11 C 總站，因為他們也懷有低水準的整個 MRN complex30，31。為了繞過這個限制，我們穩定表達 Mre11ATLD1 從 cDNA 在 Mre11−/− 細胞 (圖 1 c) 中。當向大約內源性水準表示，Mre11ATLD1 顯示模式相同的 Mre11C54 影響和恢復 NBS1 和 Rad50水準和 ATM 啟動不恢復 CtIP (圖 1 c，d)。因此，Mre11 的 C 總站具有獨特的功能，維護正常的 CtIP 水準所需。

結果 (繁體中文) 2:

我們設計了一個系統，其中全長MRE11的cDNA穩定地
從一個集成質粒載體在細胞中表達該分別Mre11cond / - 。以MRE11 - - / - ，和獨立的內生MRE11通過Mre11cond /的Cre重組酶介導轉化隨後刪除
與MRE11水平相似的內源性克隆追求進一步研究（補充圖3）。MRE11由cDNA表達Rad50的和NBS1（圖1c）的成功重組水平和支持MRN的激活的ATM激酶的能力，如通過ATM的自磷酸化（圖1d）15,35的相對水平來確定。出乎意料的是，儘管MRN的表觀恢復，CtIP蛋白水平不恢復（圖1c）。這表明，由這MRE11影響CtIP水平相比，RAD50或NBS1水平的機理是不同的。
該表達系統 ​​稠合54個氨基酸到MRE11
C末端（以下稱為Mre11C54），源自三個標記（他-V5-His）的。為了測試此大除了防止CtIP恢復的可能性，我們改造以表達融合MRE11僅五個氨基酸（Mre11C5）構成的短組氨酸標記的質粒。的確，Mre11C5表達恢復CtIP（圖1c）。因此，我們假設，MRE11的C末端具有一個未知的功能，其控制CtIP水平。因此，我們研究Mre11ATLD1 C末端缺失的影響。現有ATLD1細胞系不能用於研究MRE11 C末端的特定的角色，因為它們也懷有整個MRN complex30,31低水平。規避此限制，我們穩定表達Mre11ATLD1從cDNA中MRE11 - / -細胞（圖1c）中。表達時，以約內源性水平，Mre11ATLD1顯示相同的圖案Mre11C54的影響，並恢復了NBS1和Rad50的
水平和ATM激活而不恢復CtIP的（圖1c，d）所示。因此，MRE11的C末端具有維持正常CtIP水平需要不同的功能。

結果 (繁體中文) 3:

我們設計了一個系統，全長cDNA穩定
MRE11表示從一個集成的質粒載體，mre11cond /−細胞。內源性MRE11隨後被删除通過Cre介導的mre11cond /−轉換Mre11−/−，獨立
尅隆Mre11水准與內源性追求深造（補充圖3）。MRE11表達成功再造Rad50 NBS1基因水准（圖1c）和支持MRN啟動ATM激酶的能力，如ATM磷酸化水准相對確定（圖1d）約。出乎意料的是，儘管MRN明顯恢復，CtIP蛋白水准沒有恢復（圖1C）。這表明，Mre11影響CtIP水准相比Rad50或NBS1層面是不同的機制。
表達系統融合54個胺基酸的C末端MRE11
（以下簡稱mre11c54），來自三個標籤（his-v5-his）。測試這個大的加入封锁CtIP恢復的可能性，我們重建了質粒表達MRE11融合只有一個由五個胺基酸組成的短的組氨酸標籤（mre11c5）。事實上，mre11c5表達恢復CTIP（圖1c）。囙此，我們推測，C端具有MRE11未知函數控制CtIP水准。囙此我們研究mre11atld1 C端缺失的影響。現有的atld1細胞不能用於研究MRE11 C末端的特定角色，他們心懷低水準整個MRN complex30,31。為了繞過這個限制，我們穩定表達從發生−/−細胞cDNA mre11atld1（圖1C）。當表示為約內生水准，mre11atld1模式顯示相同的影響和恢復mre11c54 NBS1蛋白
水准和ATM啟動沒有恢復的CTIP（圖1C、D）。囙此，Mre11基因的C末端具有一個獨特的功能維持正常水准所需的資訊平臺。