The non-tumorigenic melan-a melanoc

The non-tumorigenic melan-a melanocyte lineage[19] was cultured at 37°C in humidified 95% air-5% CO2 in RPMI pH 6.9 supplemented with 5% fetal bovine serum
(Invitrogen,Scotland,UK),200 nM 12-phorbol-13-myristate acetate(PMA;Calbiochem,Darmstadt,Germany),100 U/ml penicillin, and 100 U/ml streptomycin
(Invitrogen,GrandIsland,NY).PMA activates protein kinase C,and is required for melanocytes to survival and proliferate in culture [19].Pre-malignant 4C melanocyte
lineage, non-metastatic 4C11- and metastatic 4C11+ melanoma cell lines were cultured as melan-a cells,but in the absence of PMA,since they lost the requirement
of this factor to grow.Stably Timp1-overexpressing melan-a(MaT1S) and the control MaGFP were cultured in the same conditions described above in the presence
of PMA.The plasmid construction and transfection was previously described[17].Primary human melanocytes MP#2,kindly provided by Dr.Silvya Stuchi Maria-Engler (Faculdade de Ciências Farmacêuticas,Universidade de São Paulo),was cultured at 37°C in humidified 95% air-5 %CO2 in Cascade growth medium 254(Gibco,GrandIsland,NY) supplemented with 200 μM CaCl2 and 1% HGMS (human growth melanocyte supplement).The patient-derived metastatic melanoma cells Mel2,Mel3,
Mel4,Mel11,Mel14,Mel21,Mel25,Mel28 and Mel33 kindly provided by Dr.Débora C.P. Silva (Ludwig Institute for Cancer Research,São Paulo),were cultured at
37°C in humidified 95% air-5% CO2 in RPMI pH 7.2 supplemented with 15% fetal bovine serum (Invitrogen, Scotland,UK),1 mM sodium piruvate, 2 mM Lglutamine and antibiotics (Gibco,Grand Island,NY).

結果 (中文) 1:

在湿 95%空气-5 %co2 的 RPMI ph 值 6.9 辅以 5%胎牛血清，37 ℃ 培养非致瘤体外培养小鼠黑素细胞谱系 [19]（苏格兰 Invitrogen 的英国），12-佛-13-肉豆蔻 200 毫微米醋酸酯 （PMA ；Calbiochem，达姆施塔特，德国），100 U/ml 青霉素和 100 U/ml 链霉素(Invitrogen，GrandIsland，纽约）。PMA 激活蛋白激酶 C，需黑素细胞生存和增殖文化 [19] 中。黑素细胞 4 C 预恶性血统，非转移性 4 C 11-和转移 4 11 + 黑色素瘤细胞系培养的美联一个细胞，但是在 PMA，没有因为他们丢失了要求这一因素增长。稳定超量 Timp1 表达的 melan-a(MaT1S) 和 MaGFP 控制培养液中存在上文所述的相同条件下PMA。质粒构建及基因转染是先前描述的 [17]。原发性黑素 MP #2，请提供由 Dr.Silvya Stuchi 玛丽亚-恩氏 (Faculdade de 负责 Farmacêuticas，里斯本圣保罗），在细胞培养基中湿化液的 95%，37 ℃ 空气 5 %co2 在叶栅生长介质 254(Gibco,GrandIsland,NY) 辅以 200 μ M CaCl2 和 1%高梯度磁选 （人类生长黑素细胞补编）。病人来源的转移性黑色素瘤细胞 Mel2，Mel3，Mel4、 Mel11、 Mel14、 Mel21、 Mel25、 Mel28 和 Mel33 Dr.Débora C.P.Silva (路德维格癌症研究所，圣保罗)，请提供了在培养37 ° C 的湿 95%空气-5 %co2 的 RPMI ph 值 7.2 辅以 15%胎牛血清 （英国，苏格兰 Invitrogen），1 毫米钠 piruvate，2 毫米 Lglutamine 和抗生素 (Gibco，格兰德岛，NY)。

結果 (中文) 3:

非致瘤性的Melan-A黑素细胞系[ 19 ] 37 C 95% air-5°加湿二氧化碳pH 6.9加入含5%胎牛血清培养
（公司，苏格兰，英国），200 nm 12-phorbol-13-myristate醋酸酯（PMA；Calbiochem公司，达姆施塔特，德国），100 U／ml青霉素，100 U / ml链霉素
（Invitrogen公司，纽约grandisland，PMA激活蛋白激酶C），是黑色素细胞生存需要和文化[ 19 ]恶性黑素细胞的增殖。前4
血统，非转移性和转移性黑色素瘤4C11 4C11细胞培养的细胞为Melan-A，但PMA的缺席，因为他们失去了这个因素要求
成长。稳定过表达Melan-A（1 mat1s）和控制magfp培养上述在PMA存在
相同的条件。该质粒的构建和转染先前描述的[ 17 ]。主要的人黑素细胞MP#2，博士席尔维亚stuchi玛丽亚格勒请提供（Faculdade de ciências farmacêuticas，大学ã的圣保罗），培养在37 C 95% air-5°加湿二氧化碳级联生长介质254（Gibco，grandisland，纽约）添加200和1% M CaCl2μHGMS（人类生长的黑素细胞的补充）。患者来源的转移性黑色素瘤细胞mel2，mel3，
mel4，mel11 mel14 mel21 mel25，，，，，mel33 mel28 dr.dé宝来的纯席尔瓦请提供（路德维希癌症研究所的ã，圣保罗），分别培养在
37 C 95%为air-5°加湿CO2加入pH 7.2，添加15%胎牛血清（Invitrogen公司，苏格兰，英国），1毫米2毫米lglutamine piruvate钠，抗生素（Gibco，大岛，纽约）。