2.1. MaterialsChemicals and enzymes

2.1. MaterialsChemicals and enzymes, unless specified otherwise, were purchasedfrom Sigma-Aldrich Canada Ltd, Oakville, ON.2.2. Construction and synthesis of the oligonucleotide libraryTo test the efficacy of this novel high throughput screeningmethod, a random oligonucleotide library containing Sph I and HindIII restriction sites was designed and synthesized as follows: 5′cagaattcggatccgcatgcat-(NNN)25-taagcttctcgagagatctga3′ (116 nts)(Alpha DNA Inc., Montreal, QC). Double-stranded DNA was synthesizedfrom single-stranded templates using Klenow fragment followingthe supplier's protocol (GE Healthcare, Baie d'Urfé, QC). The doublestranded DNA was purified using QIAEX II gene cleaning kit anddouble digested by Sph I and Hind III (Qiagen, Mississauga, ON).Purified DNA fragments were cloned into pET-CoCo vector (Novagen,Madison, WI) downstream of the T7 promoter and transformed intoE. coli BL21-AI host cells.2.3. Library screeningMembrane filters (d=9.0 cm; Chemical School Factory, Beijing)were placed onto Luria-Bertani (LB) agar plates (100×100 mm)supplemented with 100 mg/L ampicillin (Fig. 1A). Host cell suspensions(50 μL) containing the oligonucleotide library were spread onmembranes with a conventional plastic bacteriological glass spreader,air-dried for 10 min in a sterile laminar flow hood and incubatedovernight at 37 °C. Those membranes with evenly distributed bacterialcolonies (600–800 colonies per plate) were lifted from the agarsurface by forceps and transferred (colonies facing up) to a new LBagar plate containing 1 mM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside(IPTG) as an inducer, 100mg/L ampicillin, 0.00125% trypan blue (M.W.=960.81) and 0.0025% bromophenol blue (M.W.=670). Colonies werefurther incubated at room temperature for 1–3 h to allow for inductionof peptide expression. Those few colonies which appeared to havebeen stained blue, in relation to the whitemajority, were picked usingsterile toothpicks and stored as glycerol stocks. Clone rescuing ispossible, since not all cells within any given colony have yet expressedthe antagonistic insert.2.4. Bacterial inhibition assay for verification of antagonistic nature ofDNA insertA bacterial growth inhibition assay was performed to rule out falsepositives. To ensure each clone contained a DNA insert, cells wereinduced with a second round of IPTG and the growth rate measuredcompared to a no insert control. Host cells harboring an emptyexpression vector were detected to be trypan blue permeable at0.0001% of cases and were detected using this high throughputscreening method. Blue staining colonies (positive hits) from thepotentially lethal gene induction assays and the unstained controlcells (BL21-AI harboring empty pET-CoCo vector) were rescued bybeing picked with sterile toothpicks and grown in LB brothsupplemented with ampicillin at 37 °C overnight. The overnightcultureswere diluted to OD600=0.004 in M9 broth supplemented withampicillin. IPTG was added to the diluted bacterial cultures to a finalconcentration of 0.5 mM to induce gene expression of the clonedinsert (random oligonucleotide). The diluted cultures were incubatedat 25 °C for 6 h and their absorbancies at OD600 (A) were examined(Table 1). An arbitrary 75% inhibitory cut-off OD600 was defined asfollows: Acut-off=(Acontrol−0.004)×25%. The positive hits with absorbanciesless than Acut-off were selected for the next round ofverification.

結果 (繁體中文) 1:

2.1。材料
化學和酶，除非另有說明，均購
自Sigma-Aldrich加拿大有限公司，奧克維爾，ON。
2.2。寡核苷酸文庫的構建和合成
為了通量篩選測試這種新的高的效力
的方法，包含的Sph I和Hind隨機寡核苷酸文庫
III限制性位點，設計並合成如下：5'
cagaattcggatccgcatgcat-（NNN）25-taagcttctcgagagatctga3'（ 116 NTS）
（阿爾法DNA公司，蒙特利爾，QC）。雙鏈DNA合成
由以下單鏈模板用Klenow片段
供應商的方案（GE醫療集團，Baie的D'Urfé，QC）。雙
用QIAEX II基因清潔套件鏈DNA純化並
雙酶切的Sph I和Hind III（Qiagen公司，米西索加，ON）。
純化的DNA片段克隆到pET-的CoCo載體（Novagen，
麥迪遜，WI）的T7啟動子下游，並轉化到
大腸桿菌BL21-AI的宿主細胞。
2.3。文庫篩選
膜過濾器（d = 9.0Hz厘米;化工學校廠，北京）
被放置到的Luria-BERTANI（LB）瓊脂板（100×100mm）上
補充有100mg / L的氨芐青黴素（圖1A）。宿主細胞懸浮液
含有寡核苷酸文庫（50微升）上擴散
膜與以往的塑料細菌學玻璃吊具，
空氣乾燥在無菌層流淨化罩10分鐘，溫育
在37℃下過夜。與那些膜均勻分佈的細菌
集落（每板600-800菌落）從瓊脂解除
由鉗子表面和轉印（菌落面朝上）到一個新的LB
瓊脂含有1mM異丙基-β-d硫代半乳糖苷板
（IPTG）作為誘導劑，100mg / L的氨芐青黴素，0.00125％台盼藍（MW =
960.81）和0.0025％溴酚藍（MW = 670）。菌落
在室溫下再溫育1-3小時，以允許感應
肽表達的。那幾個殖民地這似乎已
被染成藍色，相對於whitemajority，用挑
無菌牙籤和甘油股票存放。克隆救援是
可能的，因為任何給定的群體中並不是所有的細胞已經表達
拮抗插入。
2.4。對於拮抗性質的驗證細菌抑制測定
DNA插入
進行了細菌生長抑制分析，以排除假
陽性。為了確保每個克隆含有一個DNA插入後，將細胞
用第二輪的IPTG和測量的生長速率誘導
相比，沒有插入物的控制。宿主細胞攜帶空
檢測表達載體是台盼藍滲透在
箱子0.0001％，並使用該高通量檢測
的檢查方法。從藍染色集落（陽性命中）
潛在的致命性基因誘導測定和未染色的對照
細胞（BL21-AI攜帶空的pET-的CoCo矢量）由獲救
被拾起用無菌牙籤和在LB肉湯中生長
，在37℃在補充有氨芐青黴素過夜。隔夜
在M9液體培養基稀釋至OD 600 = 0.004 cultureswere補充有
氨芐青黴素。IPTG加入到稀釋的細菌培養物至最終
為0.5mM的濃度以誘導克隆的基因表達
插入件（隨機寡核苷酸）。將稀釋的培養物溫育
在25℃下6小時，並檢測在OD600（A）其吸光
（表1）。任意的75％抑制截止OD600被定義為
如下：Acut-OFF =（Acontrol-0.004）×25％。與吸光正命中
被選定為下一輪小於Acut過
驗證。

結果 (繁體中文) 2:

2.1. 材料
購買化學品和酶，除非另有說明
來自西格瑪-奧爾德里希加拿大有限公司，奧克維爾，ON。
2.2. 寡核苷酸庫的建造與合成
測試這種新型高通量篩選的有效性
方法，一個隨機寡核苷酸庫，包含sph I和Hind
III 限制網站的設計和合成如下： 5°
卡加特加特加特加特-（NNN）25-塔加特克加特加加特加3+（116 nts）
（阿爾法DNA公司，蒙特利爾，QC）。合成雙鏈DNA
從單鏈範本使用 Klenow 片段以下
供應商協定（GE 醫療保健、Baie d'Urfé、QC）。雙
使用QIAEX II基因清洗試劑盒和
雙重消化由Sph I和Hind III（奇根，密西沙加，ON）。
純化的DNA片段被克隆成pET-CoCo載體（諾瓦根，
麥迪森，威斯康辛州）下游的T7促銷器，並轉化為
大腸桿菌BL21-AI宿主細胞。
2.3. 圖書館篩選
膜篩檢程式（d=9.0釐米;北京化工學校工廠）
放置在盧裡亞-貝爾塔尼 （LB） 瓊脂板 （100×100 毫米）
輔以100毫克/L的阿黴素（圖1A）。主機單元掛起
（50 μL） 含有寡核苷酸庫被擴散到
用傳統的塑膠細菌玻璃擴散器的膜，
在無菌層流罩中氣幹10分鐘，孵育
在37°C過夜。均勻分佈細菌的膜
殖民地（每盤600~800個菌落）從瓊脂中取出
表面由鉗子和轉移（殖民地朝上）到一個新的LB
含有1 mM等丙基-β-D-硫拉托皮拉諾賽德的瓊脂板
（IPTG） 作為誘導劑，100mg/L 阿黴素，0.00125% 錐形藍色 （M.W.*
960.81） 和 0.0025% 溴酚藍色 （M.W.=670）。殖民地是
在室溫下進一步孵育1~3小時，以便進行誘導
肽表達。那些似乎有少數殖民地
被染色的藍色，相對於白色多數，被挑選使用
無菌牙籤，並儲存為甘油庫存。克隆救援是
可能，因為不是任何特定的殖民地內的所有細胞都表示
對抗性插入。
2.4. 細菌抑制測定，用於驗證
DNA插入
進行了細菌生長抑制測定，以排除假
陽性。為了確保每個克隆包含一個DNA插入，細胞
誘導第二輪IPTG和增長率測量
與無插入控制項相比。承載空的主機單元
運算式向量被檢測到是試盤藍色滲透在
0.0001% 的案例，並且使用此高輸送量檢測到
篩選方法。藍色染色菌落（正命中）從
潛在的致命基因誘導測定和無染色對照
細胞（BL21-AI窩藏空pET-CoCo載體）被救援
被採摘與無菌牙籤和種植在LB湯
在37°C過夜補充安西林。一夜之間
培養物被稀釋到 OD600=0.004 中 M9 肉湯補充
氨 苄 西林。IPTG 被添加到稀釋的細菌培養物中，以最終
濃度為0.5 mM，誘導克隆人的基因表達
插入（隨機寡核苷酸）。被稀釋的文化被孵化
在25°C下6小時，其吸收率在OD600（A）處被檢查
（表1）。任意 75% 抑制性截止 OD600 被定義為
如下： 截止*（控制=0.004）=25%。吸收率的正命中
小於 Acutoff 被選定為下一輪
驗證。

結果 (繁體中文) 3:

2.1條。資料
化學藥品和酶，除非另有說明，都是購買的
來自Sigma Aldrich加拿大有限公司，奧克維爾，ON。
2.2條。寡核苷酸文庫的構建與合成
測試這種新型高通量篩選的效果
方法，一個隨機的寡核苷酸庫，包含Sph I和Hind
III限制性位點的設計和合成如下：
cagaattcgcgatccgcatgcat-（NNN）25-taagctctcgagatctga3′（116 nts）
（加州蒙特利爾阿爾法DNA公司）。合成了雙鏈DNA
從使用Klenow片段跟踪的單鏈範本
供應商協定（GE Healthcare、Baie d'Urfé、QC）。雙人間
用QIAEXⅡ基因清洗試劑盒純化鏈DNA
由Sph I和Hind III雙重消化（橋根，密西沙加，ON）。
純化的DNA片段被尅隆到pET CoCo載體（Novagen，
麥迪遜，威斯康辛州）T7啟動子下游並轉化為
大腸桿菌BL21-AI宿主細胞。
2.3條。圖書館篩選
膜篩檢程式（d=9.0cm；北京化工學校工廠）
放置在Luria Bertani（LB）瓊脂板上（100×100 mm）
補充100毫克/昇氨苄西林（圖1A）。宿主細胞懸液
（50μL）含有寡核苷酸文庫
使用傳統塑膠細菌玻璃撒布器的膜，
在無菌層流罩中風乾10分鐘並孵化
在37°C下過夜。那些均勻分佈細菌的膜
菌落（每盤600-800菌落）從瓊脂中取出
用鑷子將菌落表面轉移（菌落面朝上）到新的LB上
含有1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖基吡喃糖苷的瓊脂平板
（IPTG）作為誘導劑，100mg/L氨苄西林，0.00125%臺盼藍（M.W=
960.81）和0.0025%溴酚藍（M.W.=670）。殖民地
在室溫下繼續培養1-3小時，以便誘導
肽的表達。少數殖民地
被染成藍色，與大多數白人相比，是用
無菌牙籤，以甘油儲存。尅隆拯救是
可能，因為不是所有的細胞都在特定的菌落中表達
對抗性插入物。
2.4條。細菌抑制試驗驗證
DNA插入
進行細菌生長抑制試驗以排除錯誤
積極的。為了確保每個尅隆包含一個DNA插入，細胞
第二輪IPTG誘導及生長速率測定
與不插入控制項相比。宿主細胞中含有
表達載體經檢測為臺盼藍滲透性
0.0001%的病例被檢測到
篩選方法。來自
潜在致死基因誘導試驗與未染色對照
細胞（BL21-AI含有空的pET-CoCo載體）被
用無菌牙籤採摘並在LB肉湯中生長
加氨苄西林37℃過夜。一夜之間
在M9肉湯中加入
氨苄西林。將IPTG加入稀釋的細菌培養物中
0.5mm濃度誘導複製人基因表達
插入（隨機寡核苷酸）。稀釋的培養物被孵育
在25°C下放置6h，並在OD600（A）下檢測其吸光度
（錶1）。任意75%抑制性截止OD600被定義為
如下：Acut off=（Acontrol−0.004）×25%。吸光度的陽性反應
為下一輪的
驗證。