For the isolation of macrophages an

For the isolation of macrophages and neutrophils from milk and blood, total somatic cells were isolated from 50-mL milk samples as above, and total blood leukocytes were collected from 1 mL of heparinized blood by hypotonic lysis of erythrocytes. Cells from milk and blood were then incubated for 30 min on ice with allophycocyanin- conjugated anti-CD14 (Tuk4 clone, Life Technologies) and fluorescein isothiocyanate-conjugated mouse anti-bovine CD11b (CC126 clone; AbD Serotec, Raleigh, NC) in 100 μL of PBS containing 0.5% bovine serum albumin (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) and 2 mM EDTA (Fisher Scientific). Cells were then sorted on the basis of size, granularity, and intensity of fluorescein isothiocyanate and allophycocyanin fluorescence as previously described (Merriman et al., 2017) using a Sony SH800 cell sorter equipped with 405-, 488-, and 633-nm lasers (Sony Biotechnology Inc., San Jose, CA). The CD11b+CD14+ cells were considered milk macrophages or blood monocytes, and CD11b+CD14− cells were considered neutrophils. At least 10,000 CD11b+CD14+ cells and 50,000 CD11b+CD14− cells from each sample were collected with >95% purity. The sorted cells were then pelleted and lysed with RNA lysis buffer from Quick-RNA MiniPrep (Zymo Research, Irvine, CA) for later RNA isolation.

結果 (繁體中文) 1:

對於巨噬細胞和從奶和血液嗜中性粒細胞的分離，總體細胞是從50-mL的牛奶樣品中分離如上述，並且通過紅細胞的低滲裂解從1毫升的肝素化血液，收集全血白細胞。

然後從奶和血液細胞溫育30分鐘，在冰上與allophycocyanin-綴合的抗CD14（Tuk4克隆，Life Technologies）中和異硫氰酸熒光素綴合的小鼠抗牛細胞CD11b（CC126克隆; ABD Serotec公司，北卡羅來納州羅利）在100含有0.5％牛血清白蛋白的PBS液（Fisher Scientific公司，Fair Lawn的，NJ）和2mM EDTA（Fisher Scientific公司）。

細胞大小，粒度，和異硫氰酸熒光素的強度和別藻藍蛋白的熒光的基礎上如先前所述，使用分選器配備有405-，488-一個索尼SH800細胞然後排序（梅里曼等人，2017），和633-nm激光（索尼生物技術公司，聖何塞，加利福尼亞州）。

所述的CD11b + CD14 +細胞被認為乳巨噬細胞或單核細胞的血液，和CD11b + CD14-細胞被認為中性粒細胞。

具有> 95％的純度，收集至少10,000個細胞CD11b + CD14 +細胞和來自每個樣品50000的CD11b + CD14-細胞。

然後將分選的細胞沉澱，並與來自快速RNA MiniPrep試劑（ZYMO RESEARCH，歐文，CA）的RNA裂解緩衝液購買的RNA分離裂解。

結果 (繁體中文) 2:

為了從牛奶和血液中分離巨噬細胞和嗜中性粒細胞，從上述50mL牛奶樣本中分離出總體細胞，通過紅細胞的下壓性溶酶從1 mL肝素血中採集總血白細胞。

然後，從牛奶和血液中孵育出的細胞在冰上孵育30分鐘，使用過敏素青黴素結合抗CD14（Tuk4克隆，生命技術）和螢光素等同氰化物結合小鼠抗牛CD11b（CC126克隆）;AbD Serotec， 羅利， NC） 在 100 μL 的 PBS 中，含有 0.5% 牛血清白蛋白 （菲舍爾科學， 公平草坪， 新澤西州） 和 2 mM EDTA （菲舍爾科學）.

然後，使用索尼 SH800 細胞分揀機，配備 405、488-和 633-nm 雷射器，根據螢光素等位子和環青素螢光的大小、細微性和強度對細胞進行排序（如前面所述（Merriman等人，2017年）生物技術公司，聖約瑟，加利福尼亞州）。

CD11b_CD14+細胞被認為是乳巨噬細胞或血液單核細胞，CD11b_CD14+細胞被認為是嗜中性粒細胞。

從每個樣品中收集了至少10，000個CD11b_CD14+細胞和50，000個CD11b_CD14+細胞，純度為+95%。

然後，從Quick-RNA MiniPrep（Zymo Research，歐文，CA）對已分揀的細胞進行顆粒和分管，用RNA溶酶緩衝液進行細胞分離，以便以後進行RNA分離。

結果 (繁體中文) 3:

為了從牛奶和血液中分離巨噬細胞和中性粒細胞，如上所述，從50毫升牛奶樣品中分離出總體細胞，並通過低張紅細胞裂解從1毫升肝素化血液中採集總血白細胞。
然後將牛奶和血液中的細胞與异藻藍蛋白結合的抗CD14（Tuk4尅隆，生命科技）和异硫氰酸螢光素結合的小鼠抗牛CD11b（CC126尅隆；AbD Serotec，Raleigh，NC）在100μL含有0.5%牛血清白蛋白（Fisher Scientific，Fair Lawn，NJ）和2 mM EDTA的PBS中在冰上孵育30分鐘（費舍爾科學）。
然後，根據先前描述的异硫氰酸螢光素和异藻藍蛋白螢光的大小、細微性和强度對細胞進行分類（Merriman等人，2017），使用配備405、488和633納米雷射的Sony SH800細胞分類機（Sony Biotechnology Inc.，San Jose，CA）。
CD11b+CD14+細胞被認為是乳巨噬細胞或血單核細胞，CD11b+CD14-細胞被認為是中性粒細胞。
從每個樣品中至少採集10000個CD11b+CD14+細胞和50000個CD11b+CD14-細胞，純度大於95%。
然後將分選後的細胞製成顆粒，並用來自Quick RNA MiniPrep（Zymo Research，Irvine，CA）的RNA裂解緩衝液進行裂解，以便以後選取RNA。