Seventeen leaves used for the isola

Seventeen leaves used for the isolation described above were freeze-dried. Totalgenomic DNA was extracted using QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen,Hilden, Germany) according to the manufacturer's instructions. A nested PCRapproach was used to amplify a region of ITS spanning from 18S to 5.8S rDNA.The first set of primers was NSA3 (50-AAACTCTGTCGTGCTGGGGATA-30)/NLC2(50-GAGCTGCATTCCCAAACAACTC-30) (Martin & Rygiewicz, 2005) and thesecond set was ITS1-F_KYO1 (50-CTHGGTCATTTAGAGGAASTAA-30)/ITS2 (50-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-30) (White et al., 1990; Toju et al., 2012). Adapters wereadded to the 50 end of the primers ITS1-F_KYO1 and ITS2. PCR amplification cyclewith NSA3/NLC2 primers consisted of an initial denaturation step of 94 C for 5 min,followed by 35 cycles of 94 C for 30 s, 55 C for 30 s and 72 C for 30 s, and a final 5-minelongation step at 72 C.

結果 (繁體中文) 1:

上述用於分離十七葉冷凍乾燥。總
使用QIAGEN的DNeasy Plant Mini試劑盒（Qiagen公司，提取基因組DNA
根據製造商的說明，德國希爾登）。巢式PCR
方法用於從18S至5.8S rDNA的ITS擴增跨越的區域。
所述第一組的引物是NSA3（50-AAACTCTGTCGTGCTGGGGATA-30）/ NLC2
（50-GAGCTGCATTCCCAAACAACTC-30）（馬丁＆Rygiewicz，2005年）和
第二組是ITS1-F_KYO1（50-CTHGGTCATTTAGAGGAASTAA-30）/ ITS2（50-
GCTGCGTTCTTCATCGATGC-30）（White等，1990; Toju等人，2012）。適配器被
添加到引物ITS1-F_KYO1和ITS2的50月底。PCR擴增循環
與NSA3 / NLC2引物由94的初始變性步驟的？℃5分鐘，
以94 35個循環？下進行30秒，55？下進行30秒和72？下進行30秒，和最終5-分鐘
的延伸步驟在72？℃。

結果 (繁體中文) 2:

用於上述隔離的17片葉子被凍幹。總
基因組DNA提取使用QIAGEN DNeasy植物迷你套件（奇根，
希爾登，德國），根據製造商的說明。嵌套 PCR
方法用於放大從 18S 到 5.8S rDNA 的 ITS 區域。
第一套引物是NSA3（50-AAACTCTCGTGGGGGATA-30）/NLC2
（50-GAGCTCTCTCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA（馬丁·雷吉維奇，2005年）和
第二組是 ITS1-F_KYO1 （50-CTHGTTTTTGAAAA-30）/ITS2 （50-
GCTGCTTATCGATGC-30（懷特等人，1990年;Toju等人，2012年）。配接器是
添加到引注 ITS1-F_KYO1 和 ITS2 的 50 端。PCR 擴增週期
與NSA3/NLC2引注包括一個初始變性步驟94C5分鐘，
然後是 35 個週期，94 C 為 30 秒，55 C 為 30 秒，72 C 為 30 秒，最後 5 分鐘
72 C 處的伸長步長。

結果 (繁體中文) 3:

17片用於上述分離的葉子被冷凍乾燥。總計
基因組DNA是用恰根DNA簡易植物試劑盒（恰根，
德國希爾登）根據製造商的說明。巢式PCR
用該方法擴增了一個從18srdna到5.8srdna的區域。
第一組引子為NSA3（50-aaactctgtcgtctgggata-30）/NLC2
（50-gagctgattcccaaaactc-30）（Martin&Rygiewicz，2005）和
第二組是1-FäKYO1（50-cthggttagtagaastaa-30）/2（50-
GCTGCGTTCTTCGATGC-30）（White等人，1990年；Toju等人，2012年）。轉接器是
將其1-F}KYO1和2添加到引子的50端。PCR擴增週期
NSA3/NLC2引子的初始變性步驟為94 C，持續5分鐘，
接著是35個迴圈，94攝氏度持續30秒，55攝氏度持續30秒，72攝氏度持續30秒，最後5分鐘
72℃時的延伸率。